MENGIDENTIFIKASI BAKTERI SECARA UMUM

Pengertian Bakteri

Bakteri, berasal dari kata Latin, bacterium (jamak, bacteria); adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.

Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain.

            hal penting dalam identifikasi bakteri adalah mengenal morfologi bakteri tersebut, teknik membuat sediaan untuk pemeriksaan mikroskopis serta mengetahui prinsip dasar beberapa teknik pewarnaan.

            Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya.

Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.

·         Inkubasi

·         Identifikasi bakteri.

I. Morfologi Bakteri
Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat hidup di tempat yang tersebar di seluruh dunia. Morfologi bakteri diamati dengan menggunakan mikroskop..

Bentuk dasar sel bakteri meliputi coccus (bulat), bacillus (batang), bentuk bengkok atau spiral (vibrio atau spirillium). Bakteri berkembang biak dengan cara membelah diri secara sederhana, setelah pembelahan sebagian bakteri berkumpul namun ada juga yang memisahkan diri dan membentuk rantai atau dua-dua.Berdasarkan hal itu maka dikenal adanya susunan/formasi bakteri yang berbeda-beda. Perbedaan susunan tersebut dapat dijadikan salah satu alat identifikasi genus atau spesies.

2. Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba

Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:

       a)      Tersedianya oksigen atau karbondioksida       

b     b)      pH

c      c)      Suhu

d      d)     Kelembaban.

Identifikasi bakteri

Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi dengan tahapan sebagai berikut:

1) Evaluasi morfologi koloni

Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)

2) Pemeriksaan mikroskopis

Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)

3) Uji biokimia

Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya:

·         TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)

            Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan        meragi glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli           (acid/acid), Salmonella thypii (alkali/acid+H₂S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa            (alkali/alkali)

·          Fermentasi karbohidrat/gula-gula

·          MR/VP (methyl red /voges proskauer)

            Uji ini dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan     kemampuan sistem buffer dan menentukan organism yang menghasilkan prosuk      netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa

·         SIM(sulfur, indol, motility)

      Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H₂S

S   imon citrate Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.

Pewarnaan Differensial Dibagi Pewarnaan Gram Dan Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan Differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:

1.    Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

• Zat warna utama (violet kristal)
• Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
• Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
• Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

     2. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).

Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis.

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

1. Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.

Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .

2. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

    3.   Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :

• pewarnaan Neisser (granula volutin),

• pewarnaan yodium (granula glikogen).

5. Pewarnaan negatif

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.